Danni genici, mutazioni e meccanismi di riparazione del DNA

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MEDICINA ONLINE INVASIVITA VIRUS BATTERI FUNGHI PATOGENI MICROBIOLOGIA MICROORGANISMI DNA RNA GENI CROMOSOMI LABORATORIO ANALISI PARETE INFEZIONE ORGANISMO PATOGENESI MICROBIOLOGY WALLPAPERAll’interno di una cellula possono avvenire diverse tipologie di danni genetici nel DNA che possono portare alla formazione di un tumore maligno, sia spontaneamente per errori durante la replicazione, o secondariamente all’azione di cancerogeni come radiazioni (ad esempio raggi ultravioletti o raggi X) o mutageni chimici. A tal proposito vi invitiamo a leggere anche questi articoli:

I danni sono quindi di due tipi principali:

  • danni endogeni:
    • causati dall’attacco di radicali reattivi dell’ossigeno derivanti da sottoprodotti del normale metabolismo cellulare (mutazioni spontanee);
    • determinati da danni nella replicazione;
  • danni esogeni, causato da agenti esterni come:
    1. radiazioni ultraviolette provenienti dal sole (UVA 315-400 nm – UVB 280-315 nm e UVC 100-280 nm) tra questi si pensa che gli UVB rappresentano i più pericolosi anche se a causa dell’assottigliamento dell’ozono anche i raggi UVC hanno dimostrato particolare pericolosità;
    2. radiazioni di diversa frequenza, comprendenti i raggi X ed i raggi gamma;
    3. idrolisi o distruzione termica;
    4. alcune tossine vegetali;
    5. mutageni chimici prodotti dall’uomo, come gli idrocarburi derivanti dal fumo di sigaretta;
    6. chemioterapia o radioterapia.

Il danno endogeno coinvolge la struttura primaria piuttosto che la struttura secondaria della doppia elica. Esso può essere suddiviso in quattro classi:

  • ossidazione di basi e generazione di interruzioni nei filamenti di DNA ad opera di specie reattive dell’ossigeno;
  • alchilazione di basi (generalmente metilazione), con formazione, ad esempio, di 7-metilguanina;
  • idrolisi di basi, come la depurinazione e la depirimidinazione;
  • mismatch (appaiamento errato) di basi, dovute ad una replicazione del DNA in cui la base scorretta è “cucita” nel filamento che formerà la nuova molecola di DNA.

Fortunatamente, tuttavia, non tutti i danni genici portano alla formazione di mutazioni e quindi cancro: in alcuni casi il danno genetico viene riparato e solo se tale danno non viene riparato o viene riparato “male”, si origineranno mutazioni. In alcuni casi poi, se il danno genico è eccessivo, la cellula può morire. Vi sono diversi tipi di mutazioni a livello del DNA. Le mutazioni avvengono spontaneamente con una bassa frequenza. Come già anticipato, la frequenza di induzione di mutazioni può essere aumentata mediante l’uso di mutageni, come l’irraggiamento e alcuni composti chimici. Di solito i mutageni vengono utilizzati dai ricercatori per avere una maggiore probabilità di trovare un mutante di interesse in una popolazione di cellule. I mutageni chimici agiscono in diversi modi, per esempio agendo come analoghi delle basi, modificando le basi o intercalandosi nel DNA. Quest’ultimo caso determina mutazioni frameshift, mentre gli altri portano a mutazioni per sostituzione di coppie di basi.

Meccanismi di riparazione del DNA

Le cellule possiedono un certo numero di meccanismi di riparazione che funzionano correggendo almeno alcuni danni nel DNA. La riparazione del DNA è un processo che opera costantemente nelle cellule ed è essenziale alla sopravvivenza in quanto protegge il genoma da danni e mutazioni nocive, che sono estremamente frequenti: si calcola infatti che nelle cellule umane, sia le normali attività metaboliche che i fattori ambientali possano causare mediamente circa 500 mila singole lesioni molecolari per cellula al giorno (in alcuni casi fino ad un milione). Ciò fa comprendere l’importanza dei meccanismi di riparazione del genoma, senza dei quali il nostro organismo sarebbe invaso da tumori. Questi meccanismi di riparazione comprendono:

  • l’attività di correzione di bozze della DNA polimerasi, nella quale una coppia di basi che presenta un appaiamento errato nel DNA neosintetizzato, viene immediatamente riparata per rimozione da 3′ a 5′;
  • la fotoriattivazione dei dimeri di pirimidina indotti dalla luce UV;
  • la riparazione per excisione, nella quale i dimeri di pirimidina e altri danni del DNA che distorcono l’elica, vengono excisi e rimpiazzati con nuovo DNA;
  • la riparazione delle basi danneggiate da parte delle glicosilasi e delle endonudeasi AP;
  • la riparazione degli errori di appaiamento delle basi (nel quale lo stato di metilazione di una sequenza di DNA indica quale elica del DNA è di nuova sintesi, così che venga corretta la base erroneamente appaiata in quell’elica).

Ogni danno nel DNA che non viene riparato può dar origine ad una mutazione che può essere potenzialmente letale per la cellula. L’azione complessiva degli enzimi di riparazione permette di ridurre di alcuni ordini di grandezza la frequenza di mutazione. Tali meccanismi di riparazione non possono tuttavia far fronte al numero esteso di mutazioni che risultano dall’uso di muta geni chimici e da irraggiamento con UV, che quindi inducono mutazioni.

Riparazione a danno al singolo filamento

Quando solo uno dei due filamenti di un cromosoma presenta un difetto, l’altro filamento può essere usato come stampo per guidare la correzione del filamento danneggiato. Al fine di riparare il danno di una delle due eliche di DNA, ci sono numerosi meccanismi tramite i quali si può realizzare la riparazione del DNA. Questi includono:

  • Reversione diretta del danno mediante vari meccanismi specializzati. Esempi sono la metil guanina metil transferasi (MGMT) che rimuove specificamente gruppi metilici dalla guanina, e la fotoliasi nei batteri, che rompe il legame chimico creato dai raggi ultravioletti tra basi adiacenti di timina. Nessun filamento-stampo è richiesto per questo tipo di riparo.
  • Meccanismi di riparazione per escissione, che rimuovono il nucleotide danneggiato sostituendolo con un nucleotide non danneggiato complementare al nucleotide presente nel DNA non danneggiato. Questi comprendono:
    • Riparazione per escissione di base (Base Excision Repair, o BER) che ripara il danno che coinvolge un singolo nucleotide, causato da ossidazione, alchilazione, idrolisi, oppure deaminazione;il meccanismo enzimatico parte dall’attivazione di una DNA-glicosilasi che riconosce la base alterata e rompe il legame N-glicosidico, poi una AP-endonucleasi 1 (AP: sito a-purinico o apirimidinico, più in generale noto come sito abasico) elimina la base azotata, lasciando il fosfato e il deossiribosio; ancora, una liasi toglie fosfato e zucchero così che una DNA-polimerasi leghi il nuovo nucleotide e la ligasi lo incorpori nel filamento. Il BER quindi può riparare la de-aminazione della Citosina in Uracile o la trasformazione della Guanina in 8-oxo-guanina, analogo dell’adenina.
    • Riparazione per escissione di nucleotidi (Nucleotide Excision Repair, o NER), che ripara un danno che coinvolge filamenti lunghi da 2 a 30 nucleotidi. Questi includono danni da voluminosa distorsione dell’elica, quali i dimeri di timina causati da luce UV, che provocano mutazioni di un singolo filamento. La sequenza enzimatica è: il complesso XPC-hHR23B (o Rad23B) riconosce il sito da riparare, XPB e XPD (elicasi) srotolano l’elica, XPG e XPF (endonucleasi) tagliano ed eliminano l’oligonucleotide contenente il danno, DNA-polimerasi sintetizza nuovamente il DNA nel sito del danno, Dna-Ligasi che “ricuce” il filamento riparato. Una forma specializzata di NER nota come riparazione associata alla trascrizione (Transcription-Coupled Repair, o TCR) dispiega enzimi NER ad alta priorità per geni che sono attivamente trascritti;
    • Mismatch Repair (MMR), che corregge errori di replicazione e di ricombinazione genetica che determinano la formazione di nucleotidi male appaiati in seguito alla replicazione del DNA. Gli enzimi coinvolti e studiati in E. Coli sono: MutS, che riconosce il mismatch e vi si lega; MutL, attivato dal complesso DNA-MutS, che attiva a sua volta MutH, che insieme ad una endonucleasi taglia il frammento contenente il mismatch, dopo che la elicasi ha aperto la doppia elica, così che la DNA-polimerasi possa aggiungere il frammento opportuno e la ligasi unire gli estremi dei due filamenti. I corrispettivi umani di tali enzimi sono: MSH6 e MSH2 (per MutS); MLH1 e PMS2 (per MutL). Di questi quelli generalmente mutati e coinvolti nella cancerogenesi sono il MSH2 e MLH1 (v. ad esempio la sindrome del carcinoma del colon-retto non poliposico HNPCC).

Riparazione a danno associato alla trascrizione

Nonostante il genoma sia sempre “sorvegliato” in tutta la sua struttura, esistono meccanismi atti a garantire che le zone di maggior rilevanza siano corrette prima. La priorità assoluta, ad esempio, è data alla correzione delle sequenze che trascrivono per proteine che sono attivamente espresse dalla cellula. Ciò avviene perché le RNA polimerasi son capaci di bloccarsi nei siti coinvolti da una lesione, dirigendo il macchinario di replicazione in questi siti. Questo porta ad una riparazione del DNA altamente specifica ed efficiente, che garantisce di riparare prima i danni più gravi e solo dopo procedere a riparare i danni che han subito zone non significative per la vitalità della cellula.

Riparazione a danno associato a rotture del doppio filamento

Un tipo particolarmente pericoloso di danno al DNA (chiamato anche Double-Strand-Break, DSB) per le cellule in divisione è la rottura di entrambi i filamenti della doppia elica. Esistono due meccanismi capaci di riparare questo danno. Essi sono generalmente conosciuti come ‘Non-Homologous End-Joining’ (saldatura delle estremità non omologhe) e ‘riparazione per ricombinazione’ (o riparazione assistita da stampo, o ricombinazione omologa). La riparazione per ricombinazione richiede la presenza di una sequenza identica (o quasi) che possa essere usata come stampo per la riparazione di una rottura. Il macchinario enzimatico responsabile per questo processo è praticamente identico al macchinario responsabile del crossingover nelle cellule germinali durante la meiosi. Il meccanismo di riparazione per ricombinazione è usato in maniera predominante durante le fasi del ciclo cellulare in cui il DNA si sta replicando o ha completato la duplicazione. Ciò permette ad un cromosoma danneggiato di essere riparato con l’impiego, come stampo, di un cromatide fratello neosintetizzato, come una copia identica che è, per di più, ordinatamente appaiata alla regione danneggiata. Molti geni nel genoma umano sono presenti in copie multiple fornendo diverse possibili fonti di sequenze identiche. Ma la riparazione per ricombinazione che si basa su queste copie come stampi reciproci è problematico dal momento che porta a traslocazioni cromosomiche e ad altri tipi di riarrangiamento cromosomico. Il Non-Homologous End-Joining (NHEJ) riunisce le due estremità della rottura in assenza di una sequenza che possa fungere da stampo. Tuttavia può esserci una perdita di sequenza durante questo processo e quindi tale riparo può essere mutagenico. Nel NHEJ intervengono il complesso Ku70/Ku80 e la protein chinasi DNA-PK che interagiscono tra loro e riconoscono le estremità della rottura a doppio filamento. Le estremità possono essere processate, seppur in maniera limitata, dal complesso MRN che ha attività esonucleasica. Sono infine reclutate le proteine XRCC4 e la DNA ligasi 4 che ricongiungono le due estremità rotte. Il NHEJ può verificarsi a tutti gli stadi del ciclo cellulare, ma nelle cellule di mammifero è il principale meccanismo fino a quando la replicazione del DNA non rende possibile la riparazione per ricombinazione con impiego del cromatide fratello come stampo. Dal momento che la grande maggioranza del genoma negli umani e negli altri organismi pluricellulari è fatta di DNA che non contiene geni, il cosiddetto “junk DNA” o “DNA spazzatura”, un NHEJ mutagenico è probabilmente meno pericoloso di una riparazione assistita da stampo costituito da sequenze presenti in copia multipla, dato che in quest’ultimo caso si produrrebbero riarrangiamenti cromosomici indesiderati. Il macchinario enzimatico usato per il NHEJ è anche utilizzato nelle cellule B per riunire rotture generate dalle proteine RAG durante la ricombinazione VDJ, passo cruciale nella produzione della diversità degli anticorpi da parte del sistema immunitario.

Ricordiamo infine che una popolazione di cellule mutagenizzata può essere analizzata per particolari mutanti di interesse, per esempio, auxotrofi e mutazioni condizionali. Negli anni, mutanti spontanei e indotti si sono rivelati di indubbio valore per l’analisi genetica della funzione biologica. Relativamente di recente, sono state sviluppate tecniche per mutare in vitro i geni donati e rimpiazzare i geni selvatici sul cromosoma per produrre un organismo knockout. Analisi molecolari vengono utilizzate per identificare gli individui knockout omozigoti ed eterozigoti.

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