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MEDICINA ONLINE laboratorio centrifugazione in gradiente di saccarosio unità Svedberg valori S tasso di sedimentazione RNA.jpg

La tecnica della centrifugazione su gradiente di saccarosio per separare e isolare le molecole di RNA in miscela. (a) Gradiente di densità di saccarosio dal 10 al 30%. (b) Il campione di RNA è adagiato sul gradiente. (c) Dopo la centrifugazione tre tipi di RNA si separano in bande discrete. (d) Frazionamento del gradi ente per raccogliere i tipi di RNA centrifugati

La centrifugazione in gradiente di saccarosio viene generalmente usata per separare i componenti di una miscela. Con questo metodo si può misurare il tasso di sedimentazione nel gradiente dei vari componenti per effetto delle forze centrifughe. In una centrifugazione in un gradiente di saccarosio i tassi di sedimentazione sono convertiti in unità Svedberg, usando una formula opportuna. Le unità Svedberg, o più semplicemente i valori S, vengono usate per indicare approssimativamente le dimensioni relative dei componenti analizzati.

Il tasso di sedimentazione di un componente in un gradiente dipende sia dal peso molecolare, sia dalla sua conformazione tridimensionale. Due componenti con lo stesso peso molecolare, per esempio, hanno valori S diversi se l’uno è molto compatto e sedimenta rapidamente, e l’altro ha una forma più espansa e sedimenta più lentamente.

La centrifugazione in gradiente di saccarosio viene usata per separare o stimare le dimensioni delle molecole di RNA, le subunità ribosomali, i ribosomi, le proteine e i vari organelli cellulari.

Il metodo della centrifugazione in gradiente di saccarosio richiede una provetta contenente saccarosio nella quale la concentrazione aumenta dall’apice verso la base della provetta. Per separare ad esempio molecole di RNA di dimensioni diverse si prepara in una provetta da centrifuga un gradi ente continuo di saccarosio che va dal 10 all’apice al 30% alla base (vedi figura in alto nell’articolo). Successivamente una piccola quantità di campione, in questo esempio una soluzione contenente RNA, è depositata delicatamente all’apice del gradiente. Il gradiente di saccarosio è quindi centrifugato a velocità elevata per parecchie ore, durante le quali le molecole di RNA si muovono attraverso il gradiente a velocità diversa, a seconda del peso e della conformazione. Al termine della centrifugazione gli RNA con valori S simili si posizioneranno nel gradiente in zone discrete, o bande. Per raccogliere i tipi diversi di RNA, il fondo della provetta viene forato con un ago e le gocce che fuoriescono vengono raccolte in frazioni. Le frazioni che contengono gli RNA sono individuate misurando il grado di assorbimento di luce ultravioletta. Le frazioni che contengono l’RNA assorbono la luce ultravioletta, mentre quelle prive di RNA non l’assorbono. Le posizioni relative che gli RNA occupano nel gradiente indicano i valori S degli RNA. Quelli con valori S più alti (più grandi e/o più compatti) si trovano più vicino al fondo del gradiente rispetto a quelli con valori S più bassi.
È da tener presente che la centrifugazione su gradiente di saccarosio separa le molecole sulla base del loro tasso relativo di sedimentazione. Questo metodo differisce quindi dalla centrifugazione all’equilibrio su gradiente di CsCl, nella quale le molecole vengono
separate sulla base delle densità di equilibrio e non della dimensione.